В современном мире сложилась трехуровневая система диагностики инфекций. Это прикроватный тест непосредственно у постели больного, микробиологическая диагностика и различные методы секвенирования нуклеиновых кислот, которые содержатся в биологическом материале. Наряду с ними появляются методы диагностики, еще недавно казавшиеся не совсем научной фантастикой. За какими из них будущее, а какие могут кануть в Лету?
Самый первый уровень диагностики инфекции - прикроватный тест. Он нужен, чтобы определить наиболее актуальные для данного пациента патогены и быстро начать лечение. Это тесты на определение респираторных и кишечных болезнетворных микроорганизмов и вирусов. Методы всем известны: ПЦР и иммунохроматография.
Второй уровень - классическая микробиологическая диагностика. В биологических жидкостях путем посева биоматериала на различные среды определяют ведущих возбудителей основных синдромов.
Третий уровень до клинической практики еще не добрался, но он считается весьма перспективным. Это Hipothesis-free testing. Врачу не надо думать, что он собирается искать, он не формулирует предварительный диагноз и не определяет вероятность патологического процесса, а просто отдает полученный образец на секвенирование всех нуклеиновых кислот, в нем содержащихся. Так выявляются все возможные, в том числе редкие патогены.
Собака - друг человека и враг патогена
Всем хорошо известно, что болезни и микробы пахнут. Запах всех микроорганизмов определяют летучие органические соединения – их известно более 3 тысяч (спирты, кислоты, альдегиды, кетоны, циклические соединения, эфиры), рассказывает профессор кафедры микробиологии и микологии, руководитель отдела молекулярной микробиологии и эпидемиологии НИИ детских инфекций ФМБА России, главный внештатный специалист-микробиолог Комитета здравоохранения Санкт-Петербурга, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН Сергей Сидоренко. Для каждого микроба характерен свой набор летучих органических соединений. Где-то больше спиртов, где-то – кетонов. И вот уже в течение довольно долгого времени коллективы ученых по всему миру пытаются по набору летучих органических соединений создать индивидуальный портрет каждого микроорганизма. Но это долго и хлопотно, к тому же патогенам несть числа.
А у кого очень тонкое обоняние? Правильно, у собак. Исследователи надрессировали их на запах клостридий, и собачки ходили по инфекционному отделению больницы и вынюхивали у госпитализированных пациентов данные патогены, причем именно штаммы, которые образуют токсины. И делали это достаточно эффективно.
Привлекли собак и во время эпопеи с коронавирусной инфекцией. Шесть симпатичных мордашек надрессировали реагировать на запах образцов слюны или просто человека. Они обнюхали 848 человек – госпитализированных пациентов, медицинский персонал, служащих правительственных учреждений. По сравнению с ПЦР-тестами собаки показали чувствительность и специфичность выше 95%. Возможно, такой метод тоже перспективен, говорит эксперт. Наркотики и взрывчатые вещества братья наши меньшие ищут, почему не искать им еще и патогены? Но собак, конечно, надо на это натаскать.
Параллельно у больных коронавирусной инфекции определяли патологию с помощью метода газовой хроматографии и метода масс-спектрометрии. Увы, результаты не совпали. Каждый из двух методов определял повышение разных летучих соединений. Да и к тому же оказалось, что определять состав газов в выдыхаемом воздухе стоит довольно больших денег. Так что газовая хроматография и масс-спектрометрия менее эффективны, чем собачий нос, делает вывод профессор Сидоренко.
«Электронный нос»
Недавно появилась интересная технология - так называемый «электронный нос». Ставятся несколько датчиков, которые на что-то реагируют. На что именно - непонятно, но можно создать «портрет» выдыхаемого воздуха и с помощью машинного обучения сформировать «образ» патологического состояния.
Уже отработан и валидирован «электронный нос» на коронавирусную инфекцию, муковисцидоз, ХОБЛ, астму, за рубежом формулируется идея испытания «электроного носа» для обнаружения сепсиса.
В РФ Институт синтетических полимерных материалов имени Н.С. Ениколопова РАН и Центр стратегического планирования ФМБА России разработали прибор, который состоит из массива сенсоров. Он достаточно хорошо с высокой чувствительностью и специфичностью определяет пациентов с коронавирусной инфекцией, неплохо вылавливает туберкулез, может отловить пациентов с микоплазменной пневмонией, коклюшем. Сейчас пытаются приделать прибор к дыхательному контуру пациента, чтобы поймать момент, когда начинает развиваться вентилятор-ассоциированная пневмония (ВАП) — инфекционное воспаление лёгких, возникающее у людей, находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Прибор недорогой, планируются его дальнейшие испытания.
Не такое уж далекое будущее
Эксперт утверждает, что будущее - за метагеномным секвенированием («прочтением» всех молекул ДНК или РНК в биологическом образце). В научных целях это применяется при изучении состава микробиоты, микробных сообществ, описании их видового состава. В повседневной же практике важно выявить в биологическом образце фрагменты ДНК потенциальных патогенов (одного или нескольких).
Чем не поиск иголки в стоге сена? Ведь в любом биологическом образце будет колоссальное количество эукаритических (человеческих) ДНК. И как их отделить от ДНК патогена? Над этой проблемой бьются ученые всего мира. Пока что на помощь приходят химические реакции. По словам Сергея Сидоренко, на фоне человеческой ДНК уже удалось обнаружить кишечную палочку и золотистый стафилококк.
Для этого используются секвенаторы, читающие короткие и длинные последовательности - от 150-300 до 20-30 млн фрагментов или сразу всю молекулу ДНК.
Исследователи пытаются также комбинировать геномное секвенирование с биоинформатикой. Если биоинформатика покажет, что в цепочке ДНК есть что-то интересное, чтение продолжается, если обнаруживается что-то лишнее - чтение прерывается, начинают читать следующую последовательность. Благодаря этому ресурсы расходуются рациональнее, замечает эксперт.
Но сегодня весь мир склоняется к секвенированию внеклеточной ДНК. Она составляет значительную часть ДНК хозяина, которая выделяется в процессе роста или гибели, и состоит из коротких фрагментов ДНК. Они выделяются в плазму в процессе нормального клеточного обмена и быстро выводятся из кровообращения. Количество внеклеточной ДНК, характеризующее работу печени, резко увеличивается при тяжелых инфекциях. Пока что такой анализ используется только в онкологии, но область его применения надо расширять, уверен эксперт. Правда, при этом обнаруживается огромное число патогенов. Как определить, от каких надо срочно избавляться?
Больше вопросов, чем ответов
Американская компания собрала 215 тысяч биологических образцов. В местных лабораториях эти образцы изучили от и до, анализировали всеми возможными методами. И ничего не обнаружили. А их секвенирование дало 58% положительных результатов, информирует эксперт. Вот вам разница в точности разных методов диагностики.
Правда, метагеномная диагностика сегодня порождает больше вопросов, чем ответов, признается профессор Сидоренко. Есть проблемы с интерпретацией результатов, качеством самого исследования. Но не заниматься ею сегодня нельзя. И хотя сейчас она влетает в копеечку, это не значит, что в будущем метод не станет одним из лидирующих.
И еще одно преимущество секвенирования. Данный случай стал широко известен. У пациента, живущего в Японии, долго не проходило нагноение на пальце правой руки. В конце концов оно переросло в кожное воспаление, увеличился лимфоузел, пациент жаловался на боль в правой руке. Через месяц состояние еще больше ухудшилось. Рутинные лабораторные исследования (ПЦР, культуральный посев, ИФА) патогенов не выявили. В отчаянии призвали на помощь метагеномное секвенирование. Оно обнаружило очень редкий микроб. Лечение удалось подобрать, человек выздоровел.
Ретроспективная диагностика
Метагеномное секвенирование помогает понять, чем болели наши предки. В археологических человеческих останках, возраст которых определен в 30-40 млн лет, с помощью данного метода обнаруживают самые разные патогены. Благодаря метагеномному секвенированию удалось узнать, чем болели отступавшие из Москвы солдаты армии Наполеона. Оказалось, их косили сальмонеллез и другие кишечные инфекции. Более того - в Колумбии обнаружили самый древний образец трепонемы возрастом 2,5 тысячи лет. Без метагеномного секвенирования это было бы невозможно.