Началом биологической диагностики аутоиммунных ревматических заболеваний считается момент, когда в 1948 году в США в клинике Мейо при исследовании костного мозга больных красной волчанкой обнаружили лейкоциты, которые могли поглощать ядра своих собратьев. «Поглотителей» назвали «волчаночными клетками». С тех пор утекло много воды. Изменились и приборы, и методы диагностики. «волчаночные клетки» сыграли свою роль и ушли со сцены.
Основа современной диагностики аутоиммунных ревматических заболеваний - определение антинуклеарных антител (АНА), или антинуклеарного фактора. Это важнейший скрининговый тест при подозрении на данную патологию. Правильная интерпретация его результатов - ключ к постановке верного диагноза.
Еще одно прорывное открытие - ревматоидный фактор. Впервые его обнаружили Эрих Воллер и Гарри М. Роуз, когда, добавляя сыворотку крови пациентов с ревматоидным артритом к эритроцитам барана, сенсибилизированных кроличьей антиэритроцитарной сывороткой, наблюдали агглютинацию (склеивание) эритроцитов барана. Эта реакция сейчас называется пробой Воллера-Роуза.
В России иммунологическая диагностика началась благодаря А.И. Сперанскому. Именно он привез методику определения антинуклеарного и рематоидного факторов.
Что пришло на смену?
Методик определения указанных факторов перепробовали много. Это и агглютинация, и реакция фиксации комплемента, иммунопреципитация, двойная иммунодиффузия, контриммуноэлектрофрез, радиоиммуноанализ. Все методики, кроме последней, достаточно трудоемки и не очень точные, замечает ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии МКНЦ имени А.С. Логинова, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ФДПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова, доктор биологических наук Александр Новиков. Да и радиоиммуноанализ применяется довольно редко, так его вытеснили более безопасные и автоматизированные методы: иммуноферментный анализ (ИФА), и хемилюминесцентный анализ (ХЛА).
Недостатки радиоиммуноанализа:
- использование радиоактивных изотопов требует особых мер безопасности, что усложняет работу лабораторий;
- радиоактивные метки быстро распадаются, из-за чего реагенты нельзя долго хранить;
- утилизация отходов требует строгого контроля, захоронение радиоактивных материалов стоит очень дорого;
- анализаторы для ИФА и ХЛА позволяют быстро проводить масштабные исследования, радиоиммуноанализ требует больше ручного труда и занимает много времени.
Когда машина сходит с ума
«Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения антинуклеарных антител (АНА) в сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ), продолжает эксперт. В качестве субстрата (подложки) используются эпителиальные клетки рака гортани человека. При тестировании АНА методом НРИФ данные клетки традиционно обозначают как антинуклеарный фактор (АНФ). Под ним подразумевают группу аутоантител, которые вступают в тесный контакт с компонентами ядра и цитоплазмы клетки. НРИФ, как замечает Александр Новиков, на данный момент наиболее чувствителен. Только благодаря ему можно увидеть антитела в ядре, ДНК и в цитоплазме клетки.
Этот метод тоже развивается. Сначала человек смотрел в микроскоп. Глаза быстро уставали, перенапрягались, точность подсчетов падала. Когда к микроскопу приделали небольшой экран, смотреть в микроскоп стало легче. Затем к микроскопу еще приделали столик, который сам двигается, фотографирует и размещает фото на экране. Так появилась возможность накапливать изображения и сохранять их.
И, наконец, сделали станцию, которая готовит стекла. Их-то и рассматривают под микроскопом. Поэтому от качества подготовки стекол зависит результат анализа. Сейчас уже появились станции, которые и стекла готовят, и оценивают все типы свечения. Трудозатраты уменьшились в разы, и это прекрасно. Ни один человек не приготовит препарат так, как это делает автомат, уверен эксперт. Лаборатории получили высококачественные изображения и автоматическую оценку результатов тестов.
Но есть существенный нюанс. Изначально процесс автоматизировали, чтобы исключить человеческий фактор: человеку свойственно ошибаться, разные эксперты, рассматривая один и тот же препарат, могут сделать разные выводы. Машина же объективна. Она не может быть не в духе, не выспаться, поругаться с женой или с начальником.
Но к счастью для сотрудников лабораторий отказаться от микроскопа не получилось. Изображение получается слишком сложным. Надо оценить не только рисунок, но и интенсивность свечения клеток. Эта двойственность сводит машину с ума. Поэтому во всех рекомендациях написано, что все изображения все равно должен рассматривать эксперт. Порой в лабораториях, особенно коммерческих, это игнорируют и слепо доверяют автоматам. Хотя выводы машины и человека совпадают только на 75%.
Подтверждающие методы
ИФА сейчас - единственный наиболее информативный метод подтверждения аутоантител. Эксперт рекомендует для каждого вида аутоантител назначать отдельное исследование. Иначе из-за множества антигенов, вступающих друг с другом в контакт, получатся ложноположительные или ложноотрицательные результаты.
ИХЛА - современный высокоточный лабораторный метод диагностики крови, который основан на реакции «антиген-антитело». Результат оценивается по интенсивности световой вспышки (люминесценции). Отличие от ИФА в том, что в ИФА используются ферменты, которые окрашивают то, что ищут, в определенный цвет, в ИХЛА применяют световые метки, которые более чувствительны. ИХЛА благодаря этому показывает результат быстрее. Кроме того, данный метод, по словам эксперта, более чувствителен, реагенты более стабильны, расходуется их меньше. Но для скрининга он не подходит.
Иммуноблот АНА - выявляет антитела к ядру клетки. Анализ назначают для выявления и дифференциальной диагностики тяжелых системных аутоиммунных заболеваний - красной волчанки, склеродермии, синдрома Шегрена. Если первичный скрининг показал положительный результат, иммуноблот дает возможность точно определить, к каким именно антигенам появились антитела.
Здесь, как отмечает эксперт, тоже от простых методов пришли к автоматическим станциям.
Мультиплексные технологии, нейросети и ИИ
Мультиплексные технологии, которые пришли из генетики, создают возможность выявлять протеомные, генетические, метаболомные, эпигенетические и генетические маркеры патологии на самой ранней стадии ревматических заболеваний. Мультиплексные технологии позволяют в одном образце измерить сразу огромное количество маркеров. Но использовать то, что обнаружили, достаточно сложно, сетует Александр Новиков. Нужна математическая обработка результатов. Кроме того, надо еще понять, какой уровень маркера является нормой, а какой сигнализирует о неблагополучии.
Сейчас ищут биомаркеры для определения активности и выработки индекса активности ревматического заболевания. Подобные параметры уже используются для определения активности рака яичников. Прибор создан, его показывали на выставке, но это опытный обращец. Аутоантитела очень капризны, поэтому испытания продолжаются.
Не стоит также переоценивать нейросети и искусственный интеллект, считает эксперт. На данном этапе ИИ не обладает абстрактным мышлением. Его выводы надо тщательно проверять и редактировать. Но ИИ позволяет обрабатывать большие массивы данных и выделять больных с высокой активностью, например, системной красной волчанки.
В далеком будущем, надеется Александр Новиков, результаты анализов будут обрабатываться с помощью синтеза разных методов. Ученым предстоит выяснить, какие маркеры предсказывают развитие заболеваний, а практикующим врачам - перейти к превентивной диагностике.